mRNA-지질나노입자(mRNA-LNP) 기술이 코로나19 백신을 넘어 RNA 치료제, 세포치료제, 유전자편집 플랫폼으로 확장되고 있다. mRNA 생산공정, LNP 전달체, RNA 안정화, 정제·분석 전략을 초기 개발 단계부터 함께 설계해야 한다는 전문가 의견이 제시됐다.

싸토리우스코리아(대표 김덕상)는 최근 성균관대학교 삼성학술정보관에서 열린 ‘첨단 바이오의약품의 개발 및 스케일업 전략’ 세미나에서 mRNA 생산공정, LNP 전달체 개발, mRNA 안정화, 다운스트림 공정(DSP), 품질 분석 전략을 공유했다. 이번 세미나는 싸토리우스와 성균관대 미래인재 응용생명공학 교육연구단이 공동 주최했다.

문혜수 싸토리우스 매니저는 ‘mRNA 생산 및 LNP’를 주제로 대규모 mRNA 생산과 차세대 RNA 치료제를 위한 전달체 전략을 발표했다. 그는 “RNA 치료제 개발에서 전달체를 선택할 때는 GMP 등급, 글로벌 레퍼런스, 라이선스 비용과 지식재산권(IP) 이슈, 독성, 체내분포, 공정 간소화 가능성을 함께 검토해야 한다”고 말했다.

이어 그는 “mRNA 안정성, 간 축적, 특허 이슈, 안전성, 품질, 스케일업은 RNA 치료제 개발에서 반복적으로 마주치는 핵심 한계”라며 “이를 해결하려면 공정 최적화, LNP 개발, RNA 엔지니어링이 함께 가야 한다”고 강조했다.

IVT 공정, mRNA 수율과 품질 좌우

mRNA 생산공정에서 시험관 내 전사(in vitro transcription, IVT) 최적화가 핵심 과제로 제시됐다. IVT는 DNA 주형(template)을 기반으로 mRNA를 합성하는 공정으로, mRNA 치료제 생산의 출발점이다.

문 매니저는 “mRNA 생산공정에서는 IVT 조건을 얼마나 일관되게 통제하느냐가 수율과 품질을 좌우한다”고 말했다. 그는 IVT 공정의 주요 관리 변수로 DNA 주형 품질, 주형 설계, 선형화, DNA 투입량, 뉴클레오시드 삼인산(NTP) 비율, Mg²⁺ 균형, 반응 시간과 온도를 제시했다.

IVT 과정에서는 5’ cap 미부착 mRNA, 분해 RNA, 불완전 전사 RNA 절편, 이중가닥 RNA(dsRNA), RNA-DNA hybrid 등 부산물이 발생할 수 있다. 이들 부산물은 최종 mRNA 품질과 면역원성, 정제 부담에 영향을 줄 수 있다. 대량생산 단계에서 공정 파라미터 통제와 분석 기반 모니터링이 중요해지는 이유다.

문 매니저는 “대량생산에서는 IVT 공정의 일관성과 공정 파라미터 통제가 핵심”이라며 “공정 조건을 관리해 타당성을 입증해야 한다”고 강조했다.

그는 싸토리우스의 ‘Ambr 250 Modular’와 ‘PATfix IVT monitoring’ 시스템을 활용한 공정관리 전략을 제시했다. 해당 시스템은 온도와 pH를 실시간 제어하고, 시간에 따른 NTP 소진량과 RNA 생산량을 확인하는 데 활용된다. 발표에서는 유가식(fed-batch) 방식의 2g mRNA 생산 사례도 제시됐다.

전달체 전략, 즉시 사용형 시약과 제형화용 지질로 구분

LNP 전달체 전략에서는 즉시 사용형 시약(ready-to-use reagent)과 제형화(formulation)용 지질을 구분했다. RNA 치료제는 mRNA 자체의 불안정성과 세포 내 전달 한계 때문에 전달체 설계가 핵심 개발 요소로 꼽힌다.

싸토리우스는 핵산 전달 및 LNP 제형화 관련 솔루션으로 ‘in vivo-jetPEI’ ‘in vivo-jetRNA+’ ‘LipidBrick’ 계열을 구축했다. in vivo-jetPEI와 in vivo-jetRNA+는 핵산과 일정 시간 반응시킨 뒤 동물모델 주입에 활용할 수 있는 즉시 사용형 핵산 전달 솔루션이다.

문 매니저는 “미세유체 혼합(microfluidic mixing) 장비나 별도 제형화 최적화 과정 없이 사용할 수 있다는 점이 장점”이라고 말했다.

in vivo-jetPEI는 약 20년 사용 이력과 700건 이상 레퍼런스를 보유했다. DNA, RNA, siRNA, microRNA 등 다양한 핵산 전달에 활용됐고, 일부 임상 진행 사례를 바탕으로 GMP 등급 제품도 보유하고 있다.

in vivo-jetRNA+는 코로나19 백신 LNP에서 관찰되는 간 축적과 다른 체내분포 특성을 보였다. 문 매니저는 “in vivo-jetRNA+는 폐와 비장에서도 mRNA 발현 신호를 보이는 체내분포 양상을 보였고, 면역세포가 모인 조직을 표적할 수 있다는 점에서 백신 연구에 활용되고 있다”고 말했다.

국내 연구 레퍼런스 확대, 전달체 선택 신뢰도 높여

in vivo-jetPEI와 in vivo-jetRNA+의 핵산 전달 솔루션 연구 레퍼런스가 확대되고 있다. RNA 치료제 개발에서 전달체를 선택할 때는 GMP 등급, 독성, 체내분포, 공정 편의성뿐 아니라 실제 연구 활용 경험이 중요한 판단 기준으로 작용한다.

최근 국내 연구진이 국제 학술지에 발표한 논문에서 해당 핵산 전달 솔루션 활용 사례가 증가하고 있다. 대표 사례로는 지난 2월 네이처 케미컬 바이올로지(Nature Chemical Biology)에 게재된 논문 ‘무염기성 CRISPR RNA는 SpCas9의 유전체 편집 정확도를 본질적으로 활용한다(Abasic CRISPR RNAs inherently harness fidelity of SpCas9 for genome editing)’이다. 

이 논문은 무염기성 CRISPR RNA가 SpCas9의 off-target 절단을 줄이고 유전체 편집 정확도를 높일 수 있다는 연구 결과를 담았다. 연구진은 guide RNA의 화학적 변형을 통해 CRISPR-Cas9의 특이성을 개선하는 전략을 제시했다.

또 다른 사례는 지난 1월 라이프 사이언스(Life Sciences)에 게재된 논문 ‘크론병 병인 조절자로서 miR-338-3p와 miR-378a-3p의 역할: 염증성장질환에서의 잠재적 치료적 의미(Role of miR-338-3p and miR-378a-3p as regulators in Crohn's disease pathogenesis: Potential therapeutic implications in inflammatory bowel disease)’다. 

이 연구는 크론병 환자 조직과 실험적 장염 모델에서 miR-338-3p와 miR-378a-3p의 면역조절 기능을 분석했다. 공개된 논문 정보에 따르면 miRNA mimic 전달에 ‘in vivo-jetPEI’가 사용됐다.

회사는 국내 연구 현장에서 핵산 전달 솔루션의 활용 범위가 CRISPR 유전체 편집, microRNA 기반 질환 연구 등으로 넓어지고 있다고 설명했다. 전달체 선택에서 성능 지표뿐 아니라 반복적으로 축적된 연구 레퍼런스가 개발 신뢰도를 높이는 요소가 되고 있다는 것이다.

LipidBrick, LNP 제형화의 핵심 지질 전략

LipidBrick은 LNP 제형화에서 핵심 역할을 하는 양이온성 지질(cationic lipid) 계열이다. 일반적인 mRNA-LNP는 이온화 또는 양이온성 지질, 콜레스테롤, 보조 인지질, PEG 지질 등 대개 4종 핵심 지질로 구성된다. 제형화 전략에 따라 4~5종 지질 조합을 설계할 수 있다.

문 매니저는 양이온성 지질 또는 이온화 지질(ionizable lipid) 선택이 전달효율과 특허 전략을 좌우한다고 강조했다. 싸토리우스는 8종 양이온성 지질을 보유하고 있으며, 대표 지질로 ‘IM21.7c’가 있다.

그는 “LNP를 개발할 때 중요한 지표는 입자 크기, 다분산지수(PDI), 제타전위, 봉입효율 네 가지”라고 말했다. RNA LNP는 일반적으로 60~100nm 수준으로 형성되며, PDI 0.1~0.3이면 균일한 범위로 볼 수 있다. LipidBrick 사용 시에는 입자 크기 25~100nm, PDI 0.2 이하, 양전하 제타전위, 봉입효율 95% 이상 수준의 결과가 나온다.

문 매니저는 LipidBrick과 코로나19 백신에 쓰인 지질을 포함해 1944개 제형을 스크리닝한 결과도 공개했다. ‘LipidBrick IM25c’는 ALC-0315 대비 세포내 흡수, 엔도좀 탈출, ECM stability, 유전자 발현 측면에서 우수한 결과를 보였다.

mRNA 안정성, 서열 설계가 품질 좌우

mRNA 안정성 파트에서는 RNA 구조의 취약성과 서열 엔지니어링(sequence engineering) 전략을 다뤘다. RNA는 구조적으로 불안정하기 때문에 치료제로 개발하려면 서열 설계와 화학적 안정화 전략이 필요하다.

5’ Cap은 엑소뉴클레이스 방어, 번역 효율 개선, 선천면역 회피와 연결된다. 문 매니저는 TriLink의 ‘CleanCap’을 5’ cap 설계 사례로 소개했다. CleanCap은 전사 동시 캡핑(co-transcriptional capping) 방식으로 별도 캡핑 공정 부담을 줄이고, mRNA 생산공정 단축과 cap 구조 형성에 활용된다.

Poly-A tail은 IVT 주형에 서열로 포함하거나 IVT 이후 tailing하는 방식으로 설계한다. 50nt 미만에서는 분해에 취약하고, 150nt 이상에서는 번역 효율이 낮아질 수 있어 적정 길이 설정이 중요하다.

UTR도 안정성과 번역 효율을 좌우한다. 5’UTR은 리보솜 결합과 번역 효율에 관여하고, 3’UTR은 AU-rich element와 분해 조절에 연결된다. 발표에서는 Kobuvirus 3’UTR의 K5 motif가 RNA 안정성을 높일 수 있다는 기초과학연구원(IBS) RNA 연구단장 김빛내리 교수 연구팀의 사례도 다뤘다.

목적 유전자(Gene of Interest, GOI) 영역에서는 코돈 최적화, GC 함량 조절, 뉴클레오타이드 변형을 통한 서열 안정화와 특허 회피 전략을 제시했다. 문 매니저는 “RNA는 2’ 수산기 구조 때문에 골격이 끊어질 가능성이 높고 구조적으로 불안정할 수밖에 없다”며 “치료제로 활용하려면 5’ Cap, UTR, GOI, Poly-A tail을 각각 최적화해야 한다”고 말했다.

정제·분석 공정, 상업화 품질 가르는 핵심 단계

조계윤 매니저는 ‘mRNA & LNP 정제·분석’을 주제로 mRNA-LNP 개발 후반부의 다운스트림 공정(downstream process, DSP)과 품질 분석 전략을 다뤘다. 조 매니저는 mRNA-LNP 등 첨단바이오의약품에서 정제와 분석이 상업화 품질을 좌우한다고 했다.

그는 “기초연구 단계에서는 순도, 수율, 효능 중심으로 공정을 설계해도 되지만, 상업화와 허가 단계에서는 안전성, 유효성, 안정성, 공정효율, 공정비용까지 함께 고려해야 한다”고 말했다.

조 매니저는 다운스트림 공정을 여과, 크로마토그래피, 분석 세 축으로 설명했다. 크로마토그래피 파트에서는 정제와 분석 목적에 따라 FPLC와 HPLC를 구분했다. FPLC는 목적 물질을 분리·회수하는 정제 장비에 가깝고, HPLC는 분리된 물질의 정성·정량 분석에 더 적합하다는 설명이다.

조 매니저는 머무름 시간(retention time), 분리능(resolution), 동적 결합용량(DBC), 최적 결합용량(OBC), 결합-용출 모드(bind-and-elute mode), 통과 모드(flow-through mode)를 주요 공정 변수로 제시했다.

조 매니저는 “공정 효율은 단순히 많이 얻는 문제가 아니라 유속, 회수율, 로딩량, 분리능을 함께 최적화하는 문제”라며 “유속이 너무 빠르면 분리능이 떨어지고, 로딩량이 부족하면 공정 효율이 낮아질 수 있다”고 설명했다.

“분석법 없이는 품질 없다”…허가 자료 신뢰성 강조

분석법 파트에서는 허가 자료 신뢰성과 품질관리의 관계를 강조했다. 조 매니저는 “분석법 없이는 품질이 없다”며 “환자에게 투여되는 제품인 만큼 분석법 적격성평가(qualification)와 밸리데이션(validation)을 통해 데이터 신뢰성과 GMP 적합성을 확보해야 한다”고 말했다.

조 매니저는 mRNA-LNP에서 분석법의 중요성이 더 크다고 설명했다. 입자 크기, 균질성, 봉입효율이 안전성·유효성에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 특히 mRNA-LNP는 단일 분자 분석만으로 품질을 설명하기 어렵다. 봉입되지 않은 mRNA(free mRNA), LNP에 봉입된 mRNA(encapsulated mRNA), LNP 입자 특성을 함께 확인해야 한다.

조 매니저는 검출 기술로 다각도 광산란(MALS), 동적 광산란(DLS), 전하 에어로졸 검출기(CAD), 증발광산란검출기(ELSD) 등을 소개했다. 이 가운데 MALS는 수용액 상태에서 입자 크기와 분자량 정보를 확인할 수 있어 LNP와 같은 대형 바이오분자 분석에 유용한 기술로 다뤄졌다.

mRNA 정제, pDNA부터 dsRNA 제거까지 공정 연결

mRNA 정제 사례에서는 pDNA를 IVT 주형과 AAV 생산에 활용되는 핵심 원료이자 기반 공정으로 설명했다. pDNA는 mRNA 생산에서는 IVT 주형으로 쓰이고, AAV 생산에서는 helper, cap 등 생산 요소를 공급하는 플라스미드로 활용된다. pDNA 정제에서는 알칼리 용해(alkaline lysis) 이후 초나선형 pDNA(supercoiled pDNA)를 확보하는 전략을 다뤘다. 

조 매니저는 싸토리우스의 ‘CIMmultus DEAE’와 ‘CIMmultus C4 HLD’를 활용한 정제와 폴리싱(polishing) 개념을 소개했다. CIMmultus DEAE는 음전하를 띠는 pDNA를 포획하는 이온교환 기반 정제에, CIMmultus C4 HLD는 후속 폴리싱 단계에 활용되는 방식이다.

mRNA 생산에서는 IVT 이후 남은 불순물을 제거하는 정제 공정이 이어진다. 조 매니저는 Poly-A tail 활용한 올리고 dT 친화 크로마토그래피(oligo dT affinity chromatography)를 주요 전략으로 제시했다.

Poly-A tail을 가진 mRNA를 선택적으로 포획해 정제한 뒤, 역상(reverse phase) 계열의 ‘CIMmultus SDVB’ 컬럼 등으로 이중가닥 RNA(dsRNA)를 제거해 단일가닥 mRNA(single-stranded mRNA)를 확보하는 흐름이다.

조 매니저는 “oligo dT affinity chromatography는 Poly-A tail을 잡아 mRNA를 정제하는 방식”이라며 “한 번의 정제로 회수율 95%, 순도 거의 100% 수준의 결과가 도출된다”고 강조했다.

PATfix, free mRNA와 봉입 mRNA 한 번에 분석

LNP 분석에서는 free mRNA와 encapsulated mRNA를 구분해 정량하는 전략이 핵심으로 다뤄졌다. mRNA가 LNP 안에 얼마나 봉입됐는지, 봉입되지 않은 free mRNA가 얼마나 남았는지 확인해야 최종 제형의 품질을 설명할 수 있기 때문이다.

조 매니저는 싸토리우스의 ‘PATfix’ 기반 2차원 크로마토그래피/MALS 플랫폼을 소개했다. 그는 “PATfix 기반 플랫폼은 free mRNA와 LNP에 봉입된 mRNA를 분리·정량하고, LNP 입자 크기까지 한 번에 확인할 수 있다”고 설명했다.

발표에 따르면, 이 플랫폼은 1차 컬럼에서 free mRNA를 통과시켜 CIMmultus SDVB 계열 컬럼에 포획하고, LNP는 MALS에서 입자 크기를 측정한다. 이후 60℃ 조건에서 LNP를 깨 내부 mRNA를 자외선(UV) 검출기로 확인하고 봉입효율을 산출한다. 이를 통해 free mRNA, encapsulated mRNA, LNP 입자 크기를 하나의 분석 흐름에서 확인할 수 있다.

조 매니저는 “mRNA-LNP에서는 입자 크기, 균질성, 봉입효율이 안전성·유효성에 영향을 줄 수 있다”며 “제품 유래 불순물(product-related impurity)과 공정 유래 불순물(process-related impurity)을 구분해 관리해야 한다”고 말했다.

mRNA-LNP 개발 경쟁이 생산량이나 단일 전달체 효율 경쟁을 넘어섰다는 의견도 나왔다. IVT 공정 일관성, LNP 전달체의 체내분포와 지식재산권(IP) 리스크, RNA 서열 안정화, 정제공정 설계, 분석법 밸리데이션이 함께 맞물려야 상업화와 허가 단계로 이어진다.

조 매니저는 “유전자치료제에서는 다운스트림 정제(downstream purification) 단계가 가장 어렵고 까다로운 부분”이라며 “mRNA-LNP가 백신 플랫폼을 넘어 반복투여 치료제, 세포치료제, 유전자편집 플랫폼으로 확장될수록 공정과 분석을 초기부터 함께 설계하는 역량이 산업화 경쟁력을 가르는 기준이 될 전망”이라고 전했다.